正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。　　他们合力与恶势力展开斗争……“当时第五惆怅说道：现在都不要说话了，全力滋养神魂，更不要动怒。一怒则神魂一散，不能给那位中间的兄弟更多的帮助了。都闭上眼睛吧。然后我们就都闭上了眼睛，全心全意的稳固着自己的神魂境界……呵呵，那时候，虽然没有修为。但我能感觉出来，兄弟们一个个都在拼命！前所未有的拼命。就为了，在那个关键的时刻，将自己的神魂之力。转化给自己的兄弟！就只为了，那渺茫的一线生机。”